Содержание

Matrix 5.0 от Syntrax — Спортивное питание на DailyFit

Описание продукта

Перед нами первоклассный мульти-протеиновый комплекс по разумной цене. При создании продукта научный отдел компании Syntrax использовал только высококачественные источники белка – концентрат сывороточного протеина, обогащенный казеином молочный концентрат и альбумин яичного белка. В итоге получился уникальный сплав быстро и медленно усваивающихся протеинов, до краев наполненный эссенциальными аминокислотами. Идеальный протеин для стимуляции интенсивного мышечного роста и набора качественной сухой массы! Чтобы максимально раскрыть анаболический и иммуностимулирующий потенциал Matrix 5.0, в каждую порцию продукта добавлены глютаминовые пептиды. Превосходный вкус порадует даже требовательных гурманов, и это несмотря на ультранизкое содержание в продукте сахара, углеводов и жиров. Если вы регулярно используете препараты протеина, хотите добавить разнообразия и ищите великолепный вкус – попробуйте Syntrax Matrix 5.0.

ПРОБЛЕМА. Некачественные протеиновые препараты, как правило, содержат мальтодекстрин, способствующий быстрому набору жировой массы, обладают ужасным вкусом и плохо растворяются: чтобы приготовить коктейль, вам точно понадобится мощный блендер. Кроме того, в некачественном препарате вы найдете только быстрый протеин и ничего более. Конечно, такой продукт стоит дешево, но много ли найдется желающих изо дня в день подавлять рвотный рефлекс, принимая невкусный и бесполезный коктейль?

РЕШЕНИЕ. Протеиновый комплекс Matrix. На разработку продукта ушли годы, но игра стоила свеч: Matrix лишен тех недостатков, о которых мы говорили в предыдущем разделе. И главное, из состава продукта полностью исключены дешевые, некачественные источники белка, такие как денатурированный казеинат натрия или казеинат кальция. Да, себестоимость выросла в разы, но результат оправдал все ожидания. Создан протеиновый комплекс, не только обладающий превосходным вкусом, но и невероятно эффективный в плане укрепления здоровья и стимуляции важнейших процессов роста и развития тканей.

Но чтобы создать самый качественный протеиновый препарат, компании Syntrax пришлось пойти еще дальше. Они решили создать самый вкусный протеиновый порошок на рынке спортивного питания. После бесконечных экспериментов, они остановились на нескольких потрясающих ароматах, которые превращают прием продукта в акт абсолютного наслаждения.

Последним штрихом к портрету совершенства стало повышение растворимости продукта: Matrix подвергнут специальной обработке для быстрого приготовления, и теперь порция порошка мгновенно растворяется в вашем любимом напитке. Никаких комочков, никакого взбивания в блендере, никакой грязи на кухне…. Перемешали ложкой – и Matrix готов!

Способ применения

Смешать одну мерную ложку Matrix 5.0 с 240 мл воды или молока. Для тех, кто нуждается в пониженной порции протеина, половину одной мерной ложки смешать с 120 мл воды или молока. При смешивании с молоком добавляется больше калорий. Рекомендуется принимать Matrix 5.0 два-три раза в день, чтобы удовлетворить потребности в протеине. Наилучшее время приема протеина — это утром после подъема, после интенсивных физических нагрузок, таких как тренировки с весом и перед сном. Matrix 5.0 размешивается даже ложкой и имеет превосходный вкус.

Предостережения

Не рекомендуется употреблять при индивидуальной непереносимости компонентов продукта, беременным и кормящим матерям, лицам до 18 лет. Перед применением необходимо проконсультироваться с врачом.

Салонный уход «Молекулярный коктейль для волос»

В чем нуждаются ваши волосы? Непревзойденный объем или восстановление
структуры, упругость или гладкость, а может быть защита от пагубного воздействия
внешней среды? Вам определенно подойдет новая услуга от MATRIX – уход
«Молекулярный коктейль».

В основе процедуры лежит применение трех уникальных концентратов из серии
средств Total Results MATRIX. Каждый из них в зависимости от действующего
ингредиента помогает решить одну из наиболее часто встречающихся проблем волос. Так,
если у вас поврежденные, «уставшие» волосы, то вдохнуть в них новую жизнь, придать
объем и восстановить их изнутри поможет молекулярный концентрат Miracle Mopher Kick
up Protein с увеличенным содержанием протеина. А керамиды в составе Miracle Mopher
Correct It Ceramide, заполняя пустоты во внешнем слое кутикулы волоса, укрепляют их и
предотвращают ломкость. Что же касается коктейля с липидами Miracle Mopher Slim
Down Lipid, он станет незаменимым элементом салонных процедур каждой современной
девушки. Ведь волосам так необходима защита от постоянного негативного влияния
ультрафиолетового излучения, влажности и перепадов температуры.

Так как молекулярные концентраты различаются между собой по функциям и
зонам воздействия, для достижения максимального эффекта мастера подбирают
комбинацию средств для ухода за волосами каждому клиенту индивидуально. Для этого в
первую очередь стилист проводит диагностику состояния волос. Это ключевой шаг на
пути к полному преображению.

Даже после первой проведенной процедуры разница в состоянии волос более чем
заметна. Обращайтесь в авторизованные салоны MATRIX, ведь вашим волосам тоже
нужен отдых!

Стилист проведет диагностику Ваших волос для того, чтобы определить, какой состав салонного ухода «Молекулярный коктейль» подойдет именно Вам. Диагностика потребности волос — это ключевой шаг к преображению. Мастер при нанесении и определении пропорций продуктов может использовать более двадцати различных рецептов салонного ухода «Молекулярный коктейль». Узнайте в авторизованных салонах MATRIX, какой из них подойдет именно Вам!

Протеиновый коктейль (белковый коктейль) для похудения

Есть противопоказания, проконсультируйтесь с врачом.

В статье вся правда о протеине (белках) были даны ответы на вопросы: что такое протеин, для чего он нужен организму, в каких продуктах много белка, так же мы “прошлись” по разновидностям протеина и рассказали про популярные мифы.

В этой статье пойдет речь о пользе протеинового коктейля для похудения.

В фильме Джеки Браун между Бриджит Фондо и Робертом Де Ниро был следующий диалог:
— Хочешь Matrix?
— Что такое Matrix?
— Это такой коктейль, который заменяет целый обед.
— Это что диета какая-то?
— Нет, это пьют культуристы для наращивания мышц.
— Спасибо, не надо…

Итак, давайте подробней разберем, что же это за коктейль такой “Матрица” (Matrix)? Как он может помочь в похудении? Не вреден ли протеиновый коктейль, если вы не занимаетесь спортом? На эти и другие вопросы мы сегодня ответим.

Matrix от Syntrax – это смесь высококачественного протеина. Найти этот протеин можно практически в любом спортивном магазине. Есть Matrix 1.0, Matrix 2.0 и Matrix 5.0 – разницы нет никакой, кроме веса банок: 454 гр, 916 гр и 2240 гр.

Есть разные виды Matrix: сывороточный протеин, комплексный протеин и казеиновый протеин. На любой вкус: ванильный торт, шоколадный трюфель, печенье и крем, банан, клубника, шоколад, ваниль и др.

1 порция протеинового коктейля = ~ 120 ккал. В нем почти нет жиров (2 г) и углеводов (3 г), основная часть белок (23 г). Желательно разводить с водой, чтобы не увеличивать калорийность коктейля. Если Вы разводите с нежирным молоком, то калорийность будет выше примерно на 70-100 ккал.

Польза протеинового коктейля для похудения

1. Это удобно. Если вы не успеваете приготовить поесть, то коктейль вас выручит и дома и на работе, нужен всего лишь шейкер для коктейлей.

2. Выпив коктейль – голод отступит. Белки хорошо насыщают и чувство голода вас не будет тревожить какое-то время.

3. Одна порция протеинового коктейля почти на треть удовлетворяет суточную потребность в белке. (если вы занимаетесь спортом, то белка нужно больше)

4. Белковый (протеиновый) коктейль низкокалорийный.

5. Белковый коктейль не вреден, а полезен. Часто протеин путают с анаболическими стероидами, из-за этого до сих пор ходят мифы о его вредности.

Ни в коем случае нельзя заменять обычную еду протеиновыми коктейлями, это лишь дополнение к вашей диете. А то можно подумать, раз протеиновые коктейли не вредны и низкокалорийны, то можно посидеть на “протеиново-коктельной диете”. Только умеренное употребление протеиновых коктейлей полезно. Достаточно 2 коктейля в день, в первой половине дня (лучше комплексный протеин) и за 2 часа до сна (лучше казеиновый).

Нельзя использовать горячую воду при разведении коктейля, так как усвояемость белка сильно ухудшается. Соотношение жидкость-порошок не так важно, обычно для приготовления 1 порции (30 г – 1 мерная ложка) используют 200-300 мл жидкости. Коктейль можно готовить в миксере или воспользоваться обычным шейкером. Готовый белковый коктейль желательно употребить сразу + пить его лучше отдельно от еды, между приемами пищи (или после тренировки).

Мы в статье взяли как пример протеин от Syntrax (Matrix), вы можете выбрать другой, к примеру: Multipower, MHP, BSN, Optimum Nutrition, Nutrex и др. Главное смотрите на состав, не путайте протеин с гейнером! И покупайте спортивное питание в проверенных местах, чтобы не наткнуться на подделку.

P.s. Здесь можно купить протеиновый коктейль от: BSN, Optimum Nutrition, Dymatize и др.

Источник: FoodLover.Ru
Автор: Владимир Забродский

Syntrax Matrix 5.0 печенье по низким ценам в городе Курган

Протеин, имеющий лучший вкус — гарантированно!

Проблема

Ничем не примечательный протеин, который может «похвастаться» невысоким качеством, мальтодекстрином в своем составе, который ведет к накоплению жира, вкус протеина ужасен, каждый раз вам нужен блендер для размешивания протеина, и, более того, в составе присутствует всего один «быстрый» протеин. Наверняка за каждую из упаковок такого протеина просят небольшие деньги, но кто захочет связать свою ежедневную жизнь с протеином, который и неудобен, и неэффективен?

Решение

Syntrax Matrix 5.0, являясь результатом продолжительных исследований, не имеет ни одного из перечисленных выше недостатков. В составе вы не увидите дешевого, низкопробного протеинового сырья, такого как денатурированный казеинат натрия и кальция. Для достижения наилучших результатов в Syntrax Matrix используется исключительно неденатурированный протеин высочайшего качества, такой как ультрафильтрованный сывороточный протеин, ультрафильтрованный молочный протеин, неденатурированный яичный белок, а также глютаминовые пептиды. Цена выше, но качество и результат заметны моментально. Syntrax Matrix обладает отличным вкусом, улучшает здоровье организма в целом, положительно влияет на рост тканей и восстановительные процессы.

Лучшая протеиновая смесь

  • Неденатурированный сывороточный протеин
  • Мицеллярный казеин и яичный белок
  • Анаболические и антикатаболичские протеин
  • Глютаминовые пептиды
  • Легко смешивается

В качестве вкусовых араматов выбраны бесспорные лидеры: Simply Vanilla и Perfect Chocolate. Syntrax Matrix 5.0 растворяется без каких-либо усилий даже обычной ложкой, а вы получаете превосходный протеиновый коктейль. Больше никаких комочков, никаких блендеров — для Matrix 5.0 Вам может потребоваться только ложка!

Рекомендации по применению

Растворите одну- две мерные ложки Matrix 2.0 в 250-300 мл воды, нежирного молока. Принимайте Matrix 2.0 два -три раза в день, чтобы восполнить запасы протеина. Помните,что наилучшее время приема- это с утра после пробуждения, после интенсивных тренировок и перед сном.

Продукт не является лекарственным средством.
Не рекомендуем использовать продукцию лицам, не достигшим 18 лет.
Перед началом приема любого продукта обязательно проконсультируйтесь у специалиста!

Протеин SynTrax Matrix (907-980 г)

Самые выгодные предложения по Протеин SynTrax Matrix (907-980 г)

 
 


Филипп, 25.06.2020

Достоинства: не приторный


Александр Бугаков, 23.05.2020

Достоинства: Хорошо растворяется и в воде и в молоке, приятный привкус который не надоедает (брал ментоловое печенье).

Недостатки: Редко бывает на складе

Комментарий: Хороший протеин за относительно невысокую цену, хотя так и не пойму почему альпийский крем почти в 2 раза дороже?


Михаил Г., 15.04.2020

Достоинства: Шоколадный с молоком заходит хорошо
результат вижу

Комментарий: Судя по отзывам у кого-то бывают проблемы с пищеварением- на себе не обнаружил.
Вкусы обсуждать смысла особого не вижу, кому что. Вкус не как у шоколадного коктейля конечно, я пью с молоком- мне нравится.
Размешивается с теплым молоком хорошо, с холодным чуть похуже.


Константин А., 18.02.2020

Достоинства: Довольно необычный и весьма приятный для стандартных протеиновых смесей вкус. Точнее — их много, на выбор, я лично предпочитаю Orange Cream. После взбивания в блендере получается такой сливочно-нежный коктейль, тягучий и сытный, пьётся легко и приятно, но это только если готовить шейк на молоке. Без молока консистенция и вкус гораздо проще и беднее, и пить его сложнее. Цена за 900-граммовую банку — одна из самых низких среди аналогичных многокомпонентных протеинов, что вероятно обуславливается не слишком раскрученным в России брендом и невнятным в процентном соотношении содержанием ингредиентов.

Недостатки: Несмотря на громкие заявления производителя сего продукта о том, что он «идеально и моментально размешивается», и «никаких больше блендеров, пачкающих кухню и отнимающих время» — это не более, чем фантазии маркетологов. Размешать эту смесь при помощи одной только ложки, или даже ручного шейкера с шариком-пружинкой или сеточкой — нереально. Рука устанет трясти, а в итоге на дне и стенках всё равно остаются плотные комочки — скорее всего как раз та самая «клейковина». С блендером получается гораздо проще и без комочков: минута — и густой сливочный коктейль готов!

Комментарий: Весьма странный состав. Нигде более мне не встречалась в составе протеина «гидролизованная пшеничная клейковина». Запах смеси в банке довольно резкий, не сказать что отвратительный, но и не слишком притягательный. По консистенции напоминает соевый протеин, плотный и влажный, не «пылит», из мерной ложки высыпается монолитным «куличиком».


Имя скрыто, 17.11.2019

Достоинства: хороший состав, быстро размешивается в шейкере.

Недостатки: мне не подошел вкус. вроде и шоколадный, и сладкий, а все равно могу его выпить только быстро, зажмурившись и подавляя рвотный рефлекс. Если бы растворяла в молоке, возможно было бы вкуснее.

Комментарий: очень понравился состав, поэтому буду пробовать другие вкусы этого протеина.


DiZic, 29.10.2019

Достоинства: Вкусный, хорошо растворяется, нормальный состав, доступная цена

Недостатки: не нашел

Комментарий: Мне очень нравится этот протеин, пробовал шоколад, клубнику, арахисовое печенье и печенье с кремом. Все вкусы понравились. Вкусы с печеньем содержат чуть больше углеводов и мелкие крошки печенья, не всем это понравится.


victor ryzaev, 12.08.2019

Достоинства: Делает свое дело — мышечная масса росла, как положено. Отличное сочетание цена-качество. С молоком получается приятная и вкусная консистенция. Со стулом проблем не возникает.

Недостатки: После него пил whey gold. Качество в последнем кажется чуть лучше.

Комментарий: У кого с деньгами все хорошо, я бы взял голд, а кто хочет получить тот же результат при меньших затратах, то берите matrix, не пожалеете.


Антон Г., 07.08.2019

Достоинства: Нету ((

Недостатки: Вкус брал шоколад,вообще ужасный ,и так же размешивается плохо , очень плохо.

Комментарий: Не советую к покупке.


Сергей, 02.07.2019

Достоинства: Хороший насыщенный вкус. Есть два мерных стаканчика на 30 грамм каждый (второй засыпан)

Недостатки: Нет недостатков.

Комментарий: Отличный протеин. Вкус насыщенный. Особенно хорошо сочетается с молоком. В тёплом молоке хорошо размешивается ложкой за 1 минуту.


Maria Molchanova, 26.06.2019

Комментарий: вкус молочного шоколада бомбический, растворяю в воде. очень довольна

 


Алёна О., 25.05.2019

Комментарий: Отличный протеин. Соответствует цена-качество! Углеводы не сахар


Елена М., 17.04.2019

Достоинства: Хорошо растворяется, вкусный(шоколад)

Недостатки: Не нашла


Борис А., 02.03.2019

Недостатки: Сладкий. Даже слишком. Клубничный категорически невкусный. Вкус быстро надоедает до тошноты. Смешивается плохо.

Комментарий: Вроде и рабочий, но за 10 тренировок так надоел, что начало тошнить от одного вида.

Протеин Syntrax Matrix 5.0 — калорийность, полезные свойства, польза и вред, описание

Калории, ккал: 

393

Углеводы, г: 

9.5

Matrix 5.0 – популярная многосоставная протеиновая смесь от американской компании Syntrax. Упаковка продукта представляет собой ламинированный пакет на многоразовой гибкой молнии-застежке, позволяющей сохранить полезность смеси в течение всего периода употребления. В продаже доступен протеин со вкусом шоколада, ванили, а также мятного пряника, клубники и печенья «Арахисовое масло».

Калорийность протеина Syntrax Matrix 5.0

Калорийность протеина Syntrax Matrix 5.0 составляет 393 ккал на 100 грамм сухого продукта.

Состав протеина Syntrax Matrix 5.0

Для изготовления используются: ультрафильтрованный и неденатурированный концентрат сывороточного протеина, ультрафильтрованный и неденатурированный концентрат молочного протеина, включая мицеллярный казеин, неденатурированный яичный белок, гидролизованная пшеничная клейковина, натуральные и искусственные ароматизаторы, соевый лецитин, натрия хлорид, ацесульфам-К, сукралоза.

Продукт имеет насыщенный аминокислотный состав. Питательность одной порции (мерная ложка – около 30-32 грамм): калории – 120, белков – 23 г, жиров – 2 г, углеводов – 3 г, а также натрия – 150 мг и калия – 270 мг.

Упаковка содержит около 76 порций. Продукт не является лекарством.

Протеин Syntrax Matrix 5.0 в спорте

Поскольку продукт содержит три вида разных изолятов, он идеален для строительства сухой мышечной массы, уменьшения жировых отложений, обладает антиоксидантными свойствами и повышает иммунитет спортсмена (calorizator). Благодаря употреблению данного продукта обеспечивается положительный азотистый баланс и стабильный уровень инсулина в крови, что очень важно для процессов восстановления и роста мышц организма.

Способ приготовления протеина Syntrax Matrix 5.0

Для удобства измерений порций в упаковке имеется специальная мерная ложка (около 30-32 грамм смеси). На приготовление одного коктейля необходимо размешать в стакане воды или молока низкой жирности мерную ложку смеси. Важно понимать, что чем выше жирность молока, тем более калорийным получится коктейль (калоризатор). Принимать протеин можно до 2-3 раз в день: сразу после пробуждения, по окончании интенсивных тренировок и непосредственно перед сном, не забывая «вписывать» приём коктейля в свою суточную калорийность.

Противопоказания к применению протеина Syntrax Matrix 5.0

Индивидуальная непереносимость компонентов продукта, беременность и кормление грудью, лица младше 18 лет. Перед применением проконсультироваться с врачом.

Матрикс Протеиновый Коктейль Калории и Пищевая Ценность




База данных продуктов питания и счетчик калорий  




Пищевая Ценность

Размер Порции

1 мерная ложка (30 г)

Энергетическая ценность

460 кДж

110 ккал

Жиры

1,50г

Насыщенные Жиры

1,000г

Углеводы

2,00г

Белки

23,00г

Натрий

80мг

Холестерин

40мг

Калий

200мг



Редактировать этот Продукт

Эта информация неточная или неполная? Нажмите здесь, чтобы изменить.






6%

от РСК*

(110 кал)





Классификация калорий:

 

Углеводы (7%)

 

Жиры (12%)

 

Белки (81%)






* На основе РСК из 2000 калорий



Фотографии


Питательная ценность:


Кал

110

Жир

1,5г

Углев

Белк

23г




1 мерная ложка (30 г) содержит 110 калорий.
Классификация калорий: 12% жир, 7% углев, 81% белк.


Другие разновидности Протеиновый Порошок:

Недавно Употребленные Продукты:


Обратите внимание, что некоторые продукты не могут быть пригодны для некоторых людей, и Вам настоятельно рекомендуется обратиться за консультацией к врачу перед началом любой потери веса или диетического режима. Хотя информация, представленная на этом сайте представлена ​​добросовестно и считается правильной, FatSecret не дает никаких заверений или гарантий относительно её полноты или точности, и вся информация, в том числе пищевая ценность, используется вами на свой риск. Все товарные знаки, авторское право и другие формы интеллектуальной собственности являются собственностью их соответствующих владельцев.

Протеиновый порошок с замедленным высвобождением Syntrax Matrix — 9 вкусов и 3 размера!

ОПИСАНИЕ ИЗДЕЛИЯ

23 г БЕЛКА — 2 г-6 г УГЛЕВОДОВ — 1,5 г ЖИРА — 0 г АСПАРТАМА

  • Неденатурированный сывороточный протеин, мицеллярный казеин и яичный альбумин
  • Vital Nutrition для здоровья и восстановления
  • Бариатрический протеин с лучшим вкусом. . . Гарантировано
  • Глютаминовые пептиды
  • Мгновенное смешивание

СПЕЦИАЛЬНОЕ ПРЕДЛОЖЕНИЕ: Бесплатная сумка Syntrax AeroBag при покупке любых продуктов Syntrax на сумму свыше 99 долларов США.Действительно только при наличии товара!

ПРОБЛЕМА : Бариатрические протеиновые порошки низкого качества, содержащие мальтодекстрин, вызывающий ожирение, ужасный вкус, требующие блендера для правильного перемешивания и содержащие только один очень быстродействующий протеин. Несомненно, что большинство этих продуктов дешевы, но кто хочет изо дня в день заткнуть рот чем-то, что не удобно и не выгодно ???

РЕШЕНИЕ : протеиновые порошки Syntrax Matrix. На разработку правильной формулы ушли годы, Syntrax Matrix решает все проблемы, с которыми в настоящее время сталкиваются другие низкосортные протеиновые порошки Bariatric.Что наиболее важно, Syntrax полностью избегал дешевых низкокачественных источников белка, таких как денатурированный казеинат натрия и кальция. Syntrax знала, что для того, чтобы быть лучшими, они должны использовать только самые высококачественные источники протеина, такие как ультрафильтрованный сывороточный протеин, ультрафильтрованный молочный протеин, нативный яичный альбумин и глютаминовые пептиды. Затраты намного выше, но награда значительна. Эти белки не только имеют прекрасный вкус, но и не имеют себе равных по своей способности улучшать общее состояние здоровья, а также укреплять жизненно важные ткани и процессы организма.

Компания Syntrax знала, что для производства продукции высочайшего качества в отрасли ей необходимо сделать еще больше. Они решили, что не согласятся ни на что, кроме самого вкусного протеинового порошка на рынке. После бесчисленных испытаний они пришли к нескольким восхитительным вкусам, которые можно употреблять в чистом виде.

Завершая свое решение проблемы, Matrix тщательно создан, чтобы каждая мерная ложка идеально растворялась в вашем любимом напитке. Больше никаких отвратительных комков или блендеров, которые пачкают вашу кухню.. . с Matrix вам понадобится всего лишь ложка!

ЧТО ТАКОЕ МАТРИЦА?

Matrix — это смесь белковых концентратов высочайшего качества в отрасли.

ЧТО ДЕЛАЕТ MATRIX ВЫСОКОКАЧЕСТВЕННЫМ ПРОДУКТОМ, ЧЕМ КОНКУРЕНЦИЯ?

Matrix содержит комбинацию следующих трех различных высококачественных белков: сывороточный белок, мицеллярный казеин и яичный альбумин (белок яичного белка).

ПОЧЕМУ СМЕСЬ РАЗНЫХ БЕЛКОВ ВМЕСТО ОДНОГО БЕЛКА?

Действительно, существует несколько источников очень высококачественного белка, таких как яйца, казеин и сыворотка; однако ни один из них не идеален во всех аспектах.Все эти источники белка одинаковы с точки зрения общего состояния здоровья и роста мышечной ткани, но у каждого из них есть свои определенные физиологические сильные и слабые стороны. Например, яичный белок считается золотым стандартом источника белка. Он не только идеально поддерживает рост и поддержание мышечной ткани, но и содержит множество факторов роста и микроэлементов. Обратной стороной является то, что это очень дорого. С другой стороны, было показано, что сывороточный протеин является самым быстро метаболизируемым источником протеина и обладает превосходными иммуностимулирующими способностями.Было показано, что казеин является самым медленно метаболизируемым источником белка, что делает его лучшим источником аминокислот в мышечной ткани в течение длительного периода времени. Таким образом, даже несмотря на то, что употребление одного источника белка имеет много преимуществ, в конечном итоге лучший курс действий — это употребление нескольких высококачественных источников белка, чтобы минимизировать слабые стороны и максимизировать сильные стороны каждого источника.

КОГДА ЛУЧШЕЕ ВРЕМЯ ПОТРЕБИТЬ MATRIX?

Поскольку он содержит белки, которые быстро и медленно метаболизируются, он является идеальным источником белка в любое время дня.Некоторые люди будут употреблять быстродействующий источник протеина, такой как сывороточный протеин, после тренировки и потреблять медленно действующий источник протеина, такой как казеин, перед сном. Поскольку Matrix содержит протеины медленного (казеин), среднего (яичный) и быстрого (сывороточный) действия, он идеально подходит для любой ситуации. Он обладает способностью быстро бомбардировать мышечную массу тела аминокислотами, а также обеспечивать организм теми же питательными веществами в течение длительного периода времени.

ЯВЛЯЕТСЯ МАТРИЦА ПРЕВОСХОДНЫМ БЕЛКОМ ДЛЯ ЛЮДЕЙ С МЕДИЦИНСКИМИ УСЛОВИЯМИ, ТАКИМИ КАК БОЛЬНЫЕ БАРИАТРИЧЕСКОЙ ХИРУРГИИ?

Да! Аминокислотный профиль в Matrix — лучший из всех белков на рынке.Кроме того, поскольку он обеспечивает уникальные преимущества трех различных белковых концентратов, он предлагает наилучшие возможности для улучшения общего состояния здоровья и самочувствия. . . от оптимизации безжировой массы тела и уровня жировых отложений до поддержания идеального антиоксидантного статуса и поддержания надлежащего функционирования почек и иммунной системы.

У нас есть Syntrax Matrix 3-х размеров:

  • Ванны объемом 1 фунт (только Perfect Chocolate и Simply Vanilla)
  • 2-фунтовые ванны
  • 5LB мешков.

Доступен с 9 восхитительными сливочными вкусами:

  • Бананы и сливки
  • Печенье и сливки
  • Молочный шоколад
  • Мятное печенье
  • Апельсиновый крем
  • Печенье с арахисовым маслом
  • Идеальный шоколад
  • Просто ваниль
  • Клубничный крем

Предлагаемое использование:

Смешайте одну мерную ложку Syntrax Matrix с 8 унциями воды или молока.Тем, у кого меньше потребности в белке, можно запить половину мерной ложки с 4 унциями воды или молока. Обратите внимание на дополнительные калории в сочетании с молоком. Принимайте Syntrax Matrix два-три раза в день, чтобы удовлетворить ваши потребности в белке. Помните, что лучше всего употреблять протеин сразу после пробуждения утром, после интенсивных физических нагрузок, таких как силовые тренировки, и перед сном. Syntrax Matrix мгновенно смешивается ложкой и имеет прекрасный вкус … ГАРАНТИРОВАНО!

Матрица Syntrax 5.0 Пищевая ценность:

Пищевая ценность

Syntrax Matrix 2.0:

Syntrax Matrix 1.0 Пищевая ценность:

Состав: Белковая смесь (концентрат сывороточного белка, концентрат молочного белка, яичный альбумин, гидролизованный пшеничный глютен), натуральные и искусственные ароматизаторы, соевый лецитин, соль, ацесульфам калия, сукралоза

Примечание: Фактический вес продукта незначительно варьируется в зависимости от вкуса.

Рецепт и применение нового кислородного коктейля с высоким содержанием белка в питании кардиологических пациентов

Целью данного исследования было разработать рецептурный состав и оценить использование нового кислородного коктейля с высоким содержанием белка в диетической терапии кардиологических пациентов. Объектами исследования служили: контрольный образец — кислородсодержащий продукт, приготовленный с использованием молочной сыворотки, плодово-ягодного сока, высокоэтерифицированного пектина; опытные образцы кислородсодержащих продуктов, которые отличались от контрольного образца дополнительным введением гидролизата сывороточного протеина.Опытные образцы модифицировали путем добавления к ним гидролизата сывороточного протеина в количестве 1-3% от общей массы композиции. Разработана технологическая схема производства белково-углеводной основы с высоким содержанием белка 3%, определены параметры технологического процесса. Анализ химического состава продуктов показал, что в 100 г продукта содержится 3,4-3,6 г белка, 0,2-0,3 г жира, 6,0-8,0 г углеводов. Пищевая ценность продукта составила 34-46 ккал (162-196 кДж).Проведена оценка эффективности нового кислородсодержащего продукта в рационе питания в условиях кардиологического стационара. В локальное открытое проспективное исследование включены 30 пациентов в возрасте 60-75 лет, соответствующие следующим критериям: пациенты с хронической сердечной недостаточностью I-IIA функциональных классов I-II стадии, госпитализированы в кардиологическое отделение, не имея противопоказаний к энтеральной оксигенотерапии и подписал форму информированного согласия. В сочетании со стандартной терапией пациенты получали новый оксигенированный продукт с высоким содержанием белка в дозе 250 мл (из 100 г основы) ежедневно в течение 10 дней во время второго завтрака.К концу периода наблюдения, по результатам анкетирования, психоэмоциональное состояние пациентов улучшилось. Установлено, что разработанный кислородсодержащий продукт с высоким содержанием белка в сочетании со стандартной диетой и медикаментозной терапией заболевания хорошо переносился пациентами.

Протеин в напитках | 2019-10-30

KANSAS CITY — Новые ингредиенты направлены на улучшение вкуса и ощущения во рту напитков, содержащих сывороточный протеин.Некоторые из них были представлены на выставке SupplySide West 15-19 октября в Лас-Вегасе.

Arla Foods Ingredients, Виби, Дания, запустила Lacprodan Iso.Water, ингредиент изолята сывороточного протеина, разработанный для прозрачных напитков, особенно готовых к употреблению протеиновых напитков. По заявлению компании, он обеспечивает приятное ощущение во рту без привкуса протеина.

«В прошлом производители могли использовать сывороточный протеин для удовлетворения спроса на высококачественный протеин и удобство», — сказал Троелс Лаурсен, директор по здоровому и продуктивному питанию Arla Foods Ingredients.«Теперь они могут добавить к этому списку великолепный вкус и ощущение во рту, отметив все флажки для успешного запуска продукта».

Компания FrieslandCampina Ingredients, у которой есть офис в Северной Америке в Парамусе, штат Нью-Джерси, провела пробы Nutri Whey Isolate Clear в напитке с яблоком и розмарином Honeycrisp в магазине SupplySide West. По заявлению компании, Nutri Whey Isolate Clear обеспечивает прозрачность в более широком диапазоне pH и обеспечивает более низкую терпкость и менее сухое ощущение во рту. Изолят сывороточного протеина на 90% состоит из протеина.

Hilmar Ingredients, Хилмар, Калифорния, продвигает изолят сывороточного протеина 9021, полученный из сладкой молочной сыворотки и произведенный с помощью процесса фильтрации с поперечным потоком. По заявлению компании, быстрое очищение ингредиента, чистый вкус и его белковая питательная ценность делают его хорошим выбором для использования в сухих смесях напитков с низким pH. Подходит для внесения без сои.

Synergy Flavors, Inc., Воконда, штат Иллинойс, представила свой новый портфель индивидуальных вкусовых систем Dairy by Nature, которые, как было показано, улучшают вкус и текстуру напитков, включая прозрачные напитки, содержащие сывороточный протеин.

Synergy Flavors в SupplySide West взяли образцы воды с ароматом ванили и сукралозы, а также воды с ароматом ванили, сукралозы и ее системы Dairy by Nature. По словам Хейди Лю, менеджера по продукту для молочных вкусов Synergy Flavors, матрица молочного белка в ингредиенте обеспечивает более чем высший вкус. По ее словам, его функциональность обеспечивает кремообразную текстуру напитков и, как было показано, маскирует терпкость послевкусия из-за медленного высвобождения.

Synergy Flavors имеет доступ к опыту в области молочного белка через свою материнскую компанию Carbery, ирландский молочный кооператив, сказала она.

«Каждый сценарий применения создает уникальные проблемы, — говорит Корунда Пруитт, доктор философии, старший технолог Synergy Flavors. «Тем не менее, будь то создание продуктов на растительной основе или производство молочных продуктов с пониженным содержанием жира, конечной целью является переживание еды, которое формирует эмоциональную связь с потребителем. «Молочные продукты от природы» созданы для обеспечения положительных органолептических ощущений, включая вкус, текстуру, консистенцию и ощущение во рту, в широком спектре пищевых матриц ».

Помимо напитков, Synergy Flavors также позиционирует Dairy by Nature для использования в молочных продуктах, выпечке, кондитерских изделиях и пикантных продуктах, таких как соусы или сыр.

В состав Arla Foods Ingredients помимо Lacprodan Iso.Water входят еще два ингредиента.

Компания представила Lacprodan Hydro.PowerPro для порошковых коктейлей и R.-T.-D. белковые напитки. Согласно Arla Foods Ingredients, ингредиент содержит гидролизат сывороточного протеина, который усваивается легче, чем цельный сывороточный протеин. Эта черта дает организму более быстрый доступ к аминокислотам и потенциально снижает повреждение мышц. Гидролизаты сывороточного белка имеют недостаток в том, что они могут иметь горький вкус, которого нет в традиционных изолятах или концентратах сывороточного белка.Согласно Arla Foods Ingredients, Hydro.PowerPro на 50% менее горький, чем сопоставимые продукты с аналогичной степенью гидролиза.

«Преимущества гидролизата сывороточного протеина для восстановления после тренировки делают его идеальным для применения в спортивном питании», — сказала Энн Луи Фриис, менеджер по здоровью и продуктивности в Arla Foods Ingredients. «Однако его неприятный вкус — знакомая проблема при разработке продукта. Lacpropdan Hydro.PowerPro решает эту проблему, предлагая всю мощь гидролизатов сыворотки без горького вкуса.Он открывает путь для нового поколения белковых продуктов, которые действуют быстро, но при этом имеют прекрасный вкус ».

В категории протеиновых батончиков Arla Foods Ingredients предлагает Lacprodan ISO.WheyBar, смесь изолята сывороточного протеина и казеина. Смесь позволяет производителям улучшать свои протеиновые батончики, не тратя время на поиск, балансировку и смешивание многочисленных ингредиентов.

«Батончики — это очень популярный способ для внимательных потребителей увеличить потребление белка на ходу», — сказал Джо Каттерфилд, менеджер по развитию здорового и продуктивного питания в Arla Foods Ingredients.«Превосходное позиционирование может быть достигнуто за счет включения изолята сывороточного протеина, но это часто бывает сложно. Lacprodan ISO.WheyBar позволяет производителям вывести протеиновые батончики на новый уровень без головной боли при работе с многочисленными протеиновыми ингредиентами ».

какая матрица должна рассматриваться

В системах in vivo клетки имеют механическую опору во внеклеточной среде, которая не только обеспечивает общую стабильность, но также способствует межклеточному взаимодействию, адгезии, пролиферации, миграции и дифференцировке клеток.Эта механическая опора представляет собой сложный функциональный биоактивный каркас, называемый внеклеточным матриксом (ЕСМ).

Структурно фундамент ECM заложен связью сложных волокнистых белков, включая коллаген, фибронектин и ламинин. Эти белки подвижны и обладают большей прочностью на разрыв, что позволяет удерживать клетки в трехмерной структуре. Помимо них, интерстициальные пространства между этой основной цепью заполнены специализированными гидратированными протеогилканами. ЕСМ динамичны и продолжают реконструироваться для миграции и пролиферации клеток.

Поскольку система in-vivo имеет несколько ограничений в управлении функциональными анализами и решении вопросов на уровне отдельной клетки или молекулы, поэтому клетки культивируют в чашке ( in-vitro, ), чтобы иметь контролируемую среду. . Культура клеток млекопитающих в условиях in vitro, , обеспечивает большую степень манипуляции и четко определенную стадию понимания клеточной физиологии и развивает понимание механизмов.

Традиционный способ заключался в выращивании одиночной суспензии на двумерной поверхности, такой как стекло или полистирол.Хотя дальнейшие эксперименты показали, что рост на таких твердых поверхностях создает аномальную прочность на разрыв во время роста клеток, которая искажает морфологию, полярность и форму клеток в определенном аспекте. Исследования также доказали, что клетки, выращенные непосредственно на них, способствуют пролиферации атипичных клеток и уменьшают дифференцировку. Этот тип условий культивирования также сводит на нет вклад внеклеточного матрикса, который, как было показано, имеет решающее значение для клеточного развития. Чтобы исправить эту ловушку, новая система культивирования была превращена в субстанцию ​​с использованием природных или синтетических полимеров, которые использовались в качестве матрицы и позволяли клеткам расти на ней, что имитирует взаимодействие ЕСМ и окружающих клеток.Этот тип культуры называется физиологической двумерной культурой или 2,5-мерной системой культивирования.

Существует два типа матриц, которые можно использовать для разработки физиологических двумерных условий культивирования:

Биологические полимеры или биологическое покрытие

Биологическое покрытие создается с помощью макромолекул, извлеченных из тканей или клеток. Внеклеточный матрикс категорически включает два конкретных типа макромолекул: протеогликаны и волокнистые белки, где протеогликаны заполняют интерстициальные пространства, как упоминалось ранее.Волокнистые белки, такие как коллагены, фибронектины, ламинины и т. Д., Используются для биологического покрытия.

  1. Коллаген: Он присутствует в большом количестве в ЕСМ и составляет до 30% от общего белка у животных. Это способствует развитию тканей и повышению прочности клеток. Существуют разные изотипы коллагена в биологических тканях, и даже в пределах определенного типа ткани можно найти коктейль из разных изотипов, хотя обычно один изотип присутствует в изобилии.В соединительных тканях чаще всего присутствует коллаген I, II, III, V и XI типа. Коллаген используется преимущественно в фундаментальных исследованиях определенных типов клеток или клеточных линий, например, Коллаген типа II используется в качестве матрицы для роста хондроцитов и эпителиальных клеток. Коллаген I и IV типа используется в нервных клетках, мышечных клетках, гепатоцитах и ​​клетках фибробластов. Поскольку коллаген вносит большой вклад в обеспечение прочности и скелетных очертаний ткани; поэтому он идеален для изучения роста, миграции клеток и дифференцировки.
  2. Эластины: Эластин чаще всего используется в качестве биоматрицы при исследованиях рака и регенеративной медицине. Этот матрикс в основном используется для культивирования эпителиальных клеток, эндотелиальных клеток и кардиомиоцитов. Из-за непомерно высокой прочности и способности к отскоку эластиновых волокон его можно использовать для изготовления биоразлагаемых каркасов и стентов для доставки клеток in vivo .
  3. Ламинин : Ламинин, являясь важной частью базальной пластинки, был ключевой биоматрицей для экспериментов по биологии раннего развития.Благодаря липкой (или клейкой) природе ламинина (обусловленной перекрестными асимметричными дисульфидными связями) он может очень хорошо удерживать клетки, поэтому широко используется в исследованиях молекулярной и клеточной биологии. Ламинин используется в качестве биоматрицы нервных клеток, миоцитов, опухолевых клеток, эпителиальных клеток, эндотелиальных клеток и гепатоцитов для изучения подвижности, роста, межклеточного взаимодействия и сигнальных путей.
  4. Фибронектин: Фибронектин представляет собой естественную молекулу клеточной адгезии, используемую для прикрепления клеток в большом количестве клеток, таких как мезенхимальные клетки, нервные клетки, эндотелиальные клетки, эпителиальные клетки и т. Д.
  5. Matrigel matrix : Matrigel представляет собой смесь белков ЕСМ, таких как ламинин, коллаген IV, протеогликаны сульфата гепарина, энтактин / нидоген и ряд факторов роста, выделенных из саркомы мышей Энгельбрета-Холма-Роя (EHS). Это одна из наиболее распространенных матриц на основе естественных ECM, широко используемых для культивирования. Матригель подходит для культивирования поляризованных клеток, таких как эпителиальные клетки, гепатоциты, нейроны и т. Д., И способствует росту и дифференцировке.

Синтетические полимеры или химическое покрытие

  1. Поли-лизин и полиорнитин: Полиаминокислоты создают облако положительного заряда на поверхности полистирола, облегчая прикрепление клеток.Эти аминокислоты можно использовать по отдельности или в комбинации, обеспечивая более сильное электростатическое связывание между клеточной мембраной и поверхностью планшета. Синтетические полимеры широко используются для культивирования нейронов, глиальных клеток, трансфицированных клеточных линий и эпителиальных клеток.
  2. Гидрогели на основе полиакриламида : Полимеры акриламида и бис-акриламидного геля можно использовать отдельно или в смеси с любой природной биоматрицей, такой как коллаген, для культивирования различных клеток. Это выгодно, поскольку оно легко доступно, дешево и покрывает широкий диапазон модуля Юнга (сравнительная жесткость мягких тканей).

Баллов, которые необходимо учитывать при выборе матрицы для клеточной культуры:

  1. Какая поверхность требуется клеткам: гидрофобная или гидрофильная
  2. Как дополнительное покрытие поможет модельной системе расти и развиваться
  3. Какой вид уборки будет производиться после эксперимента
  4. Какова продолжительность эксперимента и как долго клетки будут выращиваться для исследования

Коктейльный набор с ингибитором протеазы

Коктейльный набор с ингибитором протеазы

Магазин не будет работать корректно, если куки отключены.

Похоже, в вашем браузере отключен JavaScript.

Для наилучшего взаимодействия с нашим сайтом обязательно включите Javascript в своем браузере.

Коктейльный набор с ингибитором протеазы

Примечания по применению

Коктейль с ингибиторами протеазы содержит ингибиторы с широкой специфичностью в отношении сериновых, цистеиновых и кислотных протеаз, а также аминопептидаз.Он был протестирован на большом количестве клеточных и тканевых экстрактов для выделения / сохранения неповрежденных белков без разложения.

Заявление об использовании

Если не указано иное, продукты MP Biomedical предназначены только для исследований или дальнейшего производственного использования, а не для прямого использования человеком. Для получения дополнительной информации, пожалуйста, свяжитесь с нашим отделом обслуживания клиентов.

Ключевые приложения

Ингибитор протеазы

.

Артикул 0215883701
Примечания по применению Набор для коктейлей с ингибиторами протеазы содержит ингибиторы с широкой специфичностью в отношении сериновых, цистеиновых и кислых протеаз, а также аминопептидаз.Он был протестирован на большом количестве клеточных и тканевых экстрактов для выделения / сохранения неповрежденных белков без разложения.
Базовый каталожный номер 15883701
Биохимические физиологические действия Протеазы — это ферменты, которые направляют свое действие на белки, расщепляя их мишени на более мелкие фрагменты, состоящие из полипептидов, пептидов и аминокислот. Существует множество протеаз, активных практически против всех белков.Некоторые протеазы достаточно специфичны, а другие расщепляют множество различных белков. Коктейль ингибиторов протеазы MP охватывает широкий спектр ингибиторов протеазы.
CAS № Не применимо
Компоненты 193503-AEBSF (40 мг), 151553-лейпептин (0,1 мг), 195368-пепстатин (0,1 мг), 195173-EDTA-Na2 (500 мг)
Номер ЕС 200-664-3
Заявление об опасности Класс 8
Размер упаковки 1 комплект
Метод приготовления Поместите содержимое всех четырех флаконов в одну мерную колбу или другую подходящую емкость.Добавьте воду или буфер по выбору до 100 мл. При желании можно приготовить более концентрированные растворы; однако лейпептин и пепстатин А будут создавать больше суспензии при концентрациях, отличных от предлагаемых. Приготовленный раствор стабилен 60-90 дней при хранении при 5 ° C. Не замораживайте приготовленный раствор и избегайте повторных циклов замораживания-оттаивания.
Типичная рабочая концентрация Типичная рабочая концентрация для 100 мл коктейля ингибиторов: AEBSF гидрохлорид: 50-400 мг / мл; Дигидрат динатрия ЭДТА: 0.2-25 мг / мл; Гемисульфат лейпептина: 0,5-1 мг / мл; Пепстатин А: 0,5-1 мг / мл
Заявление об использовании Если не указано иное, продукты MP Biomedical предназначены только для исследований или дальнейшего производственного использования, а не для прямого использования человеком. Для получения дополнительной информации, пожалуйста, свяжитесь с нашим отделом обслуживания клиентов.

Анализ ингибирующей активности индуцирующего реверсию богатого цистеином белка с мотивами Kazal (RECK) на матриксных металлопротеиназах

Векторы экспрессии

Плазмида pBS-hRECK (подробности о конструкциях, плазмидах, векторах и праймерах см. В таблице 1) полноразмерная кДНК RECK человека в векторе pBlueScript любезно предоставлена ​​Макото Нода, Киото (Япония).Конструкции, кодирующие фрагменты RECK∆C (плазмида pS6-RECK∆C; остатки G 27 -S 942 ), KL123 (pCri9a-KL123; S 621 -S 797 ) и KL23 (pCri9a 69347) -S 797 ) (фиг.1), а также кодирующая последовательность для остатков A 22 -Q 313 (UP Q9BQ16) N-концевой области яичка 3 человека (N-TES; плазмида pS6-NTES) в синтетическом гене (от GenScript) амплифицировали с праймерами, которые вводили сайты для направленного клонирования.Для бактериальной экспрессии для вставки между сайтами рестрикции Nco I и Xho I. Для бактериальной экспрессии использовали плазмиду pCri9a 38 , которая добавляет C-концевой гексагистидин (His 6 ) -тег. Для экспрессии в клетках млекопитающих использовали вектор pCMV-Sport 6 (Thermo Scientific) с исходным сигнальным пептидом (для RECK∆C) или с лидерной последовательностью κ иммуноглобулина мыши (для N-TES) для вставки генов между Sma I. / Asi SI и Bst EII / Asi SI, соответственно.Для экспрессии RECKΔC в клетках насекомых ген RECK вставляли в вектор pIEx (Novagen) путем клонирования без рестрикции в рамке с сигнальным пептидом адипокинетического гормона, как описано ранее 39 , с получением плазмиды pIE-RECKΔC. Праймеры и ДНК-модифицирующие ферменты для стадий полимеразной цепной реакции (ПЦР) были приобретены у Sigma-Aldrich и Thermo Scientific соответственно. ПЦР выполняли с использованием ДНК-полимеразы Phusion High Fidelity (Thermo Scientific) в соответствии с инструкциями производителя с дополнительной стадией оптимизации с помощью температурного градиента после каждой реакции.ДНК очищали с помощью набора для очистки OMEGA Biotek Purification Kit (Omega) или GeneJET Plasmid MaxiPrep Kit (Thermo Scientific) в соответствии с инструкциями производителя, и все конструкции проверяли секвенированием ДНК. Плазмида pET3a-MT1∆C (см. Таблицу 1), кодирующая про- и каталитические домены MMP-14 (S 24 -G 284 ; UP P50281) плюс дополнительный N-концевой метионин 40 любезно предоставлено Йошифуми Ито, Оксфорд (Великобритания).

Таблица 1 Конструкции, праймеры, плазмиды и белки.

Культура эукариотических клеток и временная трансфекция

Drosophila melanogaster эмбриональные клетки Шнайдера (S2; Gibco), адаптированные к суспензии, а также полученные из HEK293 клетки Expi293F (Expi; Gibco) и ExpiCHO-S, полученные из клеток яичников китайского хомячка (Expi-CHO; Gibco), поддерживали в среде экспрессии Sf-900 II SFM и FreeStyle F17 (Gibco) для клеток насекомых и млекопитающих соответственно. В обе среды добавляли 0,5 мкг / мл амфотерицина B (Gibco), 100 единиц / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина (Sigma).Кроме того, в среду FreeStyle F17 добавляли 8 мМ L-глутамин и 0,2% Pluronic F-68 (Gibco).

Expi и Expi-CHO клетки выращивали до плотности 3–5 × 10 6 клеток / мл и 4–6 × 10 6 клеток / мл, соответственно, и субкультивировали каждые 3–4 дня путем разведения до 0,3–0,5 × 10 6 клеток / мл и 0,2–0,3 × 10 6 клеток / мл соответственно. С этой целью их инкубировали при 37 ° C в Multitron Cell Shaker Incubator (Infors HT) при 150 об / мин в увлажненной атмосфере с 8% CO 2 .Затем клетки субкультивировали до 0,7 × 10 6 клеток / мл и трансфицировали через 24 ч при плотности клеток 1 × 10 6 клеток / мл с добавлением по каплям смеси 1 мг векторной ДНК (см. Таблицу 1) и 3 мг линейного полиэтиленимина 25 кДа (Polysciences Europe) в 20 мл среды Opti-MEM (Gibco) на литр среды для экспрессии. Смесь предварительно инкубировали при комнатной температуре в течение 15–20 мин. Через 3 дня супернатант клеточной культуры собирали для очистки белка.

клеток S2 выращивали до плотности 12–16 × 10 6 клеток / мл, субкультивировали путем разведения до 4 × 10 6 клеток / мл каждые 3–4 дня и инкубировали при 28 ° C в Innova 42. Шейкер-инкубатор (New Brunswick Scientific) при перемешивании со скоростью 200 об / мин. Клетки субкультивировали до 6 × 10 6 клеток / мл и трансфицировали через 24 ч при плотности клеток 12 × 10 6 клеток / мл с добавлением по каплям смеси 0,6 мкг ДНК (см. Таблицу 1) и 2 мкг. линейного полиэтиленимина 25 кДа на 10 6 клеток.Смесь предварительно инкубировали при комнатной температуре в течение 15–30 мин. Трансфицированные клетки разбавляли до 4 × 10 6 клеток / мл после 1 ч инкубации при 28 ° C при перемешивании при 200 об / мин, и супернатант клеточной культуры собирали через 7 дней для очистки белка.

Бактериальная экспрессия

Плазмиды pCri9a-KL123 и pCri9a-KL23 трансформировали в компетентные клетки Lemo21 (DE3) Escherichia coli (New England Biolabs) и высевали на чашки Luria-Bertani (LB).Пятьдесят миллилитров лизогенного бульона инокулировали одной бактериальной колонией и инкубировали в течение ночи при 37 ° C при перемешивании при 220 об / мин. Пять миллилитров этого преинокулята использовали для инокуляции 500 мл лизогенного бульона, и клетки оставляли для роста при 37 ° C до OD 600 ≈ 0,7. Затем культуры охлаждали до 20 ° C и экспрессию белка индуцировали 0,4 мМ изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозидом (IPTG; Duchefa) в течение 18–20 часов. В чашки LB и бульон для лизогения добавляли 50 мкг / мл канамицина (Fisher Bioreagents) и 34 мкг / мл хлорамфеникола (Fluka).

Для экспрессии каталитического домена (CD) ММР-14 клеток E. coli BL21 (DE3) (Sigma) трансформировали плазмидой pET3a-MT1∆C. Сто миллилитров лизогенного бульона инокулировали единственной колонией и инкубировали в течение ночи при 28 ° C при перемешивании со скоростью 200 об / мин. Десять миллилитров этого преинокулята использовали для инокуляции 500 мл лизогенного бульона, и клетки оставляли для роста при 37 ° C до OD 600 ≈ 0,6. Затем клетки индуцировали 0,5 мМ IPTG и выдерживали в течение 5 ч при 37 ° C.В чашки LB и бульон для лизогении добавляли 100 мкг / мл ампициллина (Apollo Scientific).

Очистка белка

Для очистки RECK∆C от клеток Expi супернатант клеточной культуры очищали при 4 ° C центрифугированием при 3500 × g в течение 30 минут, стерилизовали фильтрованием и концентрировали в 20 раз с помощью VivaFlow 200 Кассетный аппарат с поперечным потоком с мембраной Hydrosart с отсечкой 30 кДа (Sartorius). Затем концентрированный супернатант подвергали диализу против 75-кратного объемного избытка буфера 20 мМ Трис · HCl pH 7.5, 150 мМ хлорид натрия. После добавления 20 мМ имидазола к диализованному супернатанту RECK∆C улавливали с помощью аффинной хроматографии на никель-нитрилотриуксусной кислоте (Ni-NTA) (AC) на колонке HisTrap HP (GE Healthcare), предварительно промытой буфером A (50 мМ Tris · HCl pH 7,5, 1 М хлорид натрия, 500 мМ имидазол) и уравновешивают буфером A без имидазола. Белок промывали и элюировали ступенчатым градиентом имидазола (2%, 4%, 12% и 60% буфера A). Наличие протеолитической примеси во фракциях, содержащих RECK∆C, оценивали путем инкубации с 1 мг / мл фибриногена из плазмы человека (Sigma) в буфере B (50 мМ Трис · HCl, pH 7.5, 150 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, 50 мкМ хлорида цинка) в течение ночи при 37 ° C. Для удаления этой примеси и получения RECK∆C высокой степени чистоты белок инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре с 1 мг / мл 4- [2-аминоэтил] бензолсульфонилфторида (AEBSF, коммерческое название Pefabloc, Sigma) и дополнительно очищали по размеру. эксклюзионная хроматография (SEC) на колонке Superdex200 (GE Healthcare Life Sciences), уравновешенной буфером A без имидазола.

Для производства и очистки конструкции RECK FRAG-1 (см. Рис.1) высокоочищенный RECK∆C инкубировали с 20-кратным молярным избытком MMP-14 CD в буфере B в течение ночи при 37 ° C. Фрагменты расщепления очищали с помощью SEC в колонке Superdex75 (GE Healthcare Life Sciences), уравновешенной буфером C (50 мМ Трис · HCl pH 7,5, 150 мМ хлорид натрия). Наличие протеолитической активности во фракциях, содержащих FRAG-1, оценивали, как указано выше, с фибриногеном.

Для очистки RECK∆C от клеток S2 или Expi-CHO очищенный супернатант клеточной культуры подвергали диализу против 17-кратного объемного избытка буфера 20 мМ Трис · HCl pH 7.4, 250 мМ хлорид натрия, 20 мМ имидазол. RECK∆C в супернатанте улавливали AC со смолой Ni-NTA (Thermo Scientific) путем инкубации в течение ночи при 4 ° C. Затем его загружали в открытую колонку для периодической очистки (Bio-Rad), тщательно промывали и элюировали 4% и 60% буфера A соответственно. Наличие протеолитической активности оценивали, как указано выше, для фибриногена. Частично очищенный белок дополнительно очищали с помощью SEC в колонке Superdex 200 10/300 (GE Healthcare), уравновешенной буфером C (RECK∆C из клеток S2) или буфером A без имидазола (RECK∆C из клеток Expi-CHO).

Для очистки N-TES в очищенный супернатант клеточной культуры добавляли 20 мМ имидазол и инкубировали в течение 3–4 ч со смолой Ni-NTA. Затем его загружали в открытую колонку для периодической очистки AC (Bio-Rad), тщательно промывали и элюировали 4% и 60% буфером A соответственно. Элюированные фракции объединяли, обессоливали и концентрировали, и наличие протеолитической активности оценивали, как указано выше, с фибриногеном. Эту активность подавляли, как описано выше, и последующую очистку с помощью SEC проводили в колонке Superdex 75 10/300 (GE Healthcare), уравновешенной буфером A без имидазола.

Для очистки конструкций RECK KL23 и KL123 бактериальные клетки собирали центрифугированием при 3500 × g в течение 30 мин при 4 ° C и ресуспендировали в холодном буфере 50 мМ Трис · HCl pH 7,5, 250 мМ хлорида натрия, 2 мМ. этилендиаминтетраацетат (ЭДТА). Клетки лизировали с помощью разрушителя клеток (Constant Systems) при давлении 1,35 кБар, и неклассические тельца включения выделяли центрифугированием при 48000 × g в течение 30 минут при 4 ° C и сначала промывали буфером 100 мМ Трис · HCl pH. 7.5, полностью без ЭДТА (коктейль ингибиторов; Roche, Sigma), 2 М мочевина, 2% Тритон Х-100, а затем дважды с буфером D (50 мМ Трис · HCl pH 7,5, коктейль ингибиторов, 2 М мочевина). Промытые тельца включения ресуспендировали в буфере D и выдерживали 48 ч при перемешивании при комнатной температуре. Нерастворимый белок удаляли центрифугированием при 48000 × g в течение 30 минут при 4 ° C, и в супернатант добавляли 20 мМ имидазола. Белок улавливали AC в колонке HisTrap HP (GE Healthcare), предварительно промытой буфером E (50 мМ Tris · HCl pH 7.5, 250 мМ хлорида натрия, 500 мМ имидазола) и уравновешивают буфером 50 мМ Трис · HCl pH 7,5, 250 мМ хлорида натрия, 20 мМ имидазола. Фрагменты RECK промывали и элюировали 20 мМ и 300 мМ имидазолом (0% и 60% буфера E) соответственно. Частично очищенные белки полировали с помощью SEC в колонке Superdex75 (GE Healthcare) с буфером C.

Чистый CD MMP-14 был получен из телец включения путем адаптации опубликованного протокола 41 . Соответственно, бактериальные клетки собирали центрифугированием при 3500 × g в течение 30 минут при 4 ° C и промывали 20 мМ Трис · HCl pH 8.0, 20% сахарозы в течение 10 мин при 37 ° С при перемешивании при 220 об / мин. Затем клетки ресуспендировали в буфере F (20 мМ Трис · HCl pH 8,0) и выдерживали при осторожном перемешивании в течение ночи при комнатной температуре. После этого к лизированным клеткам добавляли сначала дезоксихолат (Sigma) в концентрации 1,25 мг / мл, а затем ДНКазу I (Roche) в концентрации 1 мг / мл на 3 часа. После еще 2 ч инкубации тельца включения собирали центрифугированием при 6500 × g в течение 15 мин при 4 ° C и ресуспендировали в буфере F с 0,5% Triton X-100.Затем тельца включения растворяли в буфере 20 мМ Трис · HCl pH 8,6, 50 мкМ хлорида цинка, 20 мМ 1,4-дитио-D, L-треитола (DTT; Thermo Scientific), 8 М мочевины. Их дополнительно очищали ионообменной хроматографией (IEC) в колонке Resource Q объемом 6 мл (GE Healthcare), предварительно промытой буфером G (20 мМ Трис · HCl pH 8,6, 0,4 М хлорид натрия, 50 мкМ хлорид цинка, 1 мМ DTT, 8 M мочевина) и уравновешивают буфером G без хлорида натрия. Применяли ступенчатый градиент 0%, 25%, 50% и 100% буфера G, и фракции, содержащие белок, объединяли.Затем их разбавляли до 0,2 мг / мл буфером 50 мМ Трис · HCl pH 8,6, 150 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, 100 мкМ хлорида цинка, 1 мМ DTT, 6 М мочевины, с добавлением цистамина (20 мМ) и сложены в два последовательных этапа диализа при 4 ° C. Первую стадию выполняли в течение ночи против 10-кратного объемного избытка буфера 50 мМ Трис · HCl pH 8,6, 150 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, 100 мкМ хлорида цинка, 5 мМ β-меркаптоэтанола, 1 мМ 2-гидроксиэтилдисульфида. Второй этап выполняли с 10-кратным избытком объема буфера B дважды в течение 4 часов, а затем в течение ночи.Эта процедура вызвала активацию MMP-14 при удалении продомена. Осажденный белок удаляли центрифугированием при 48000 × g в течение 30 минут при 4 ° C. Впоследствии CD MMP-14 был сконцентрирован и дополнительно очищен с помощью SEC в колонке Superdex75 (GE Healthcare) с буфером B.

Другие применяемые процедуры были аналогичны процедурам из предыдущих публикаций группы, например 42 . В частности, идентичность и чистота белков оценивали с помощью 10–14% гелей глицина в SDS-PAGE, окрашенных кумасси бриллиантовым синим, путем фингерпринта пептидной массы расщепленных триптических белков и путем N-концевого секвенирования через деградацию по Эдману.Последние два анализа были выполнены в Службе химии белков и на объектах протеомики Centro de Investigaciones Biológicas (Мадрид, Испания). Этапы ультрафильтрации выполнялись с использованием фильтрующих устройств Vivaspin 15, Vivaspin 2 и Vivaspin 500 с отсечкой от 3 до 30 кДа (Sartorius Stedim Biotech). Концентрации белка обычно оценивали путем измерения OD 280 на спектрофотометре (NanoDrop; GE Healthcare) и применения соответствующих теоретических коэффициентов экстинкции.Конкретные концентрации также измерялись с помощью набора для анализа белков BCA (ThermoFisher Scientific) с использованием бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта.

Многоугловое рассеяние лазерного света

Для определения реальной молекулярной массы RECKΔC было выполнено многоугловое рассеяние лазерного света (SEC-MALLS), как сообщалось ранее 42 в аппарате Dawn Helios II (Wyatt Technologies), подключенном к колонка SEC Superdex 200 10/300 Increase, уравновешенная буфером 20 мМ Трис · HCl pH 7,4, 150 мМ хлорида натрия при 25 ° C на совместной кристаллографической платформе IBMB / IRB, Научный парк Барселоны (Каталония, Испания).Для обработки и анализа данных использовалось программное обеспечение ASTRA 7 (Wyatt Technologies), для которого было принято типичное значение dn / dc для белков (0,185 мл / г). Все эксперименты проводили в трех повторностях.

Анализы протеолитического ингибирования

Анализы ингибирования с флуорогенными белками и пептидными субстратами проводили во флуориметре для микропланшетов (Infinite M200, TECAN) в реакционных объемах 100 мкл. Протеолитическую активность MMP-2, MMP-7 и MMP-9 (все от R&D Systems) измеряли с помощью набора EnzCheck Assay Kit на основе флуоресценции, содержащего желатин DQ ( λ ex = 490 нм и λ em = 520 нм) в виде конъюгата флуоресцеина (Invitrogen) при 12.5 мкг / мл. Пептидолитическую активность MMP-14 CD измеряли с флуорогенным субстратом FS-6 (Mca-KPLGL-Dnp-Dpa-AR-NH 2 ; λ ex = 325 нм и λ em = 400 нм; Sigma) при 5 мкМ. Реакции проводили при 37 ° C в буфере H (50 мМ Трис · HCl pH 7,5, 150 мМ хлорид натрия, 10 мМ хлорид кальция, 50 мкМ хлорид цинка, 0,05% Brij-35), за исключением MMP-2 и MMP-7. , для которого буфер H с добавлением 1 мМ 4-аминофенилртути ацетата (APMA, Sigma) использовали для активации соответствующих зимогенов путем инкубации в течение 1 ч при 37 ° C.Ингибирование измеряли после предварительной инкубации 2-, 5-, 10-, 50- и 100-кратного молярного избытка тестируемых белков (KL23, KL123, RECK∆C, FRAG-1 и N-TES) с MMP-2 (0,35 нг), MMP-7 (9,8 нг), MMP-9 (2,5 нг) или MMP-14 CD (50 нг) в течение 1 ч при 37 ° C. К реакционной смеси добавляли субстраты и измеряли остаточную протеолитическую активность в течение 3 часов. Относительные активности MMP-2, MMP-7 и MMP-9 против флуорогенных белковых субстратов определяли по наклону зависимости флуоресценции отвременная кривая. Напротив, флуорогенные пептиды расщеплялись слишком быстро для правильного определения наклона, поэтому относительную активность MMP-14 перед FS-6 определяли по абсолютным значениям флуоресценции, измеренным между 40 и 50 мин после начала реакции. Контрольную активность KL23, KL123, RECKΔC, FRAG-1, N-TES и BSA измеряли между 110 и 120 мин после начала реакции. Бычий сывороточный альбумин (BSA; Sigma) при 100-кратном молярном избытке и о-фенантролин (Fluka) при 5 мМ были включены в качестве отрицательного и положительного контролей для ингибирования, соответственно.Кроме того, анализы ингибирования расщепления фибронектина плазмы человека (pFN, MP Biomedicals) оценивали с помощью вестерн-блоттинга (см. Ниже). MMP-2 или MMP-7 (при 40 нМ) инкубировали в буфере H плюс 1 мМ APMA для активации с pFN (4 нМ) при 37 ° C в течение 0, 1, 2, 4, 6, 8 или 18 часов. с или без RECK∆C (400 нМ). В контроле использовали ингибиторы ММП широкого спектра действия маримастат (Sigma), EDTA (Fluka), о-фенантролин и батимастат (Calbiochem), а также ингибиторы сериновой пептидазы AEBSF и фенилметансульфонилфторид (PMSF; Acros Organics) плюс полный коктейль ингибиторов без ЭДТА.

Вестерн-блоттинг

Образцы белка разделяли 10% глициновым SDS-PAGE, переносили на нитроцеллюлозные мембраны Amersham Protran Premium NC (GE Healthcare Life Sciences) и блокировали в течение одного часа при осторожном перемешивании при комнатной температуре с помощью 50 мл блокирующего раствора. (5% BSA в фосфатно-солевом буфере [PBS] плюс 0,2% Tween 20 [PBS-T]; Sigma). Фибронектин был обнаружен путем инкубации в течение ночи при 4 ° C с кроличьим поликлональным первичным антителом (Abcam), разведенным 1: 5000 в PBS-T с 1% BSA, и последующей инкубацией в течение 2 часов при комнатной температуре с вторичным антителом, конъюгированным с HRP кролика. (Sigma) разбавили PBS-T в соотношении 1: 8000.Блоты инкубировали с мягким буфером для отгонки (1,5% глицина, pH 2,2, 0,1% SDS, 1% Tween 20), а затем промывали PBS и PBS-T при осторожном перемешивании при комнатной температуре. Блоты повторно блокировали и повторно зондировали.

His 6 белков с меткой детектировали с помощью моноклональных конъюгированных антител His-HRP (Santa Cruz Biotechnology), разведенных 1: 5000 в PBS-T с 1% BSA, инкубировали в течение ночи при 4 ° C и затем визуализировали с помощью системы усиленной хемилюминесценции. (Super Signal West Pico Chemiluminescent; Pierce) в соответствии с инструкциями производителя.Мембраны подвергали воздействию пленок Hyperfilm ECL (GE Healthcare Life Sciences).

Разное

Расчеты прогнозирования структуры посредством нарезания резьбы были выполнены с помощью LOMETS 43 и RAPTORX 44 со стандартными параметрами.

Хроматин IP

Сшивка клеточной культуры и подготовка образцов

Для получения оптимальных результатов ChIP используйте приблизительно 4 × 106 клеток для каждого эксперимента.Один дополнительный образец должен быть обработан для анализа расщепления и концентрации хроматина. Включите в эксперимент одну дополнительную чашку с клетками, которая будет использоваться для определения количества клеток с помощью гемоцитометра.
• Перед запуском

• Теплый коктейль с 200-кратным ингибитором протеазы (PIC) и 10-кратный раствор глицина. Перед использованием убедитесь, что PIC полностью разморожен.
• Приготовьте 2 мл PBS + 10 мкл 200X PIC на 15 см чашку и поместите в нее лук.
• Приготовьте 40 мл PBS на каждую чашку длиной 15 см, которую нужно обработать, и положите на нее лук.
• Приготовьте 540 мкл 37% (мас. / Об.) Формальдегида на 15-сантиметровую чашку с клетками и храните при комнатной температуре. Используйте свежий формальдегид, срок годности которого не истек.

1. Чтобы сшить белки с ДНК, добавьте 540 мкл 37% (мас. / Об.) Формальдегида в каждую 15-сантиметровую культуральную чашку, содержащую 20 мл среды. Коротко встряхните, чтобы перемешать, и инкубируйте 10 мин при комнатной температуре. Конечная концентрация формальдегида — 1%.
2. Чтобы погасить формальдегид, добавьте 2 мл 10-кратного глицина в каждую 15-сантиметровую чашку, содержащую 20 мл среды, быстро встряхните, чтобы перемешать, и инкубируйте 5 минут при комнатной температуре.
3. Для суспензии клеток перенесите клетки в коническую пробирку на 50 мл, центрифугируйте при 1500 об / мин в течение 5 минут при 4 ° C и дважды промойте осадок 20 мл ледяного PBS. Удалите супернатант и немедленно продолжите подготовку ядер и расщепление хроматина.
4. Для прилипших клеток удалите среду и дважды промойте клетки 20 мл ледяного 1X PBS.
5. Добавьте 2 мл ледяного PBS + PIC в каждую 15-сантиметровую чашку. Соскребите клетки в холодный буфер. Объедините клетки из всех чашек для культивирования в одну коническую пробирку на 15 мл.
6. Центрифугируйте клетки при 1500 об / мин в течение 5 минут при 4 ° C. Удалите супернатант и немедленно продолжите подготовку ядер и расщепление хроматина.

Подготовка ядер и расщепление хроматина

Перед началом
• Теплый коктейль с 200-кратным ингибитором протеазы (PIC). Перед использованием убедитесь, что он полностью разморожен.
• Подготовьте 1 M DTT. Убедитесь, что кристаллы DTT полностью находятся в растворе.
ВАЖНО : После растворения храните 1M DTT при -20 ° C.
• Нагрейте 10-кратный буфер ChIP и убедитесь, что SDS полностью растворен.
• Приготовьте 1 мл 1X буфера A + 0,5 мкл 1M DTT + 5 мкл 200X PIC на препарат IP и поместите его на лед.
• Приготовьте 1,1 мл 1X буфера B + 0,55 мкл 1M DTT на препарат IP и поместите его на лед.
• Приготовьте 100 мкл буфера 1X ChIP + 0,5 мкл 200X PIC для каждого препарата IP и поместите его на лед.

ВАЖНО : Шаги в этой части должны выполняться на льду или при 4 ℃.
1. Ресуспендируйте клетки в 1 мл ледяного 1X буфера A + DTT + PIC.Инкубируйте лук 10 мин. Перемешать перевернутой пробиркой несколько раз.
2. Центрифуга при 3000 об / мин в течение 5 мин при 4 ° C для осаждения ядер. Удалите супернатант и ресуспендируйте осадок в 1 мл ледяного 1X буфера B + DTT. Повторите этот шаг еще раз, затем снова суспендируйте осадок в 100 мкл 1X Buffer B + DTT. Перенести в микроцентрифужную пробирку на 1,5 мл (всего до 1 мл на пробирку).
3. Для хроматического переваривания добавьте в пробирку микрококковую нуклеазу, несколько раз перемешайте, переворачивая пробирку, и инкубируйте в течение 20 минут при 37 ° C с частым встряхиванием для расщепления ДНК до длины приблизительно 150-900 п.н.Перемешивать каждые 3-5 минут переворачиванием. Количество микрококковой нуклеазы, необходимое для переваривания ДНК до оптимальной длины, может потребоваться эмпирически для определения отдельных тканей и клеточных линий.
4. Остановите расщепление, добавив 10 мкл 0,5 М ЭДТА на IP-препарат.
5. Центрифуга при 13000 об / мин в течение 1 мин при 4 ° C для осаждения ядер и удаления супернатанта.
6. Ресуспендируйте ядерный осадок в 100 мкл 1X ChIP Buffer + PIC и инкубируйте на льду в течение 10 мин.
7. Обработайте ультразвуком до 500 мкл лизата на 1,5 мл микроцентрифужную пробирку с несколькими импульсами для разрушения ядерной мембраны.Инкубируйте образцы в течение 30 секунд на влажном льду между импульсами. Оптимальные условия, необходимые для полного лизиса ядер, можно определить, наблюдая ядра под световым микроскопом до и после обработки ультразвуком. В качестве альтернативы ядра можно лизировать с использованием гомогенизатора.
8. Осветите лизаты центрифугированием при 10 000 об / мин в течение 10 мин при 4 ° C.
9. Перенесите супернатант в новую пробирку. Продукт представляет собой препарат сшитого хроматина. Хранится при -80 ° C для дальнейшего использования. (Удалите 50 мкл препарата хроматина для анализа переваривания и концентрации хроматина)

Анализ расщепления и концентрации хроматина

1.К 50 мкл образца хроматина добавьте 100 мкл воды, свободной от нуклеаз, 6 мкл 5 М NaCl и 2 мкл РНКазы A. Вихревой раствор перемешайте и инкубируйте при 37 ° C в течение 30 мин.
2. Добавьте 2 мкл протеиназы K. Вортекс перемешайте и инкубируйте при 65 ° C в течение 2 часов.
3. Очистите ДНК от образцов, используя спин-колонки для очистки ДНК.
4. После очистки ДНК удалите образец объемом 10 мкл и определите размер фрагмента ДНК с помощью электрофореза на 1% агарозном геле с маркером ДНК 100 п.н. ДНК должна быть переварена до длины примерно 150-900 п.н. (от 1 до 5 нуклеосом).
5. Определите концентрацию ДНК.
ПРИМЕЧАНИЕ : Для получения оптимальных результатов ChIP очень важно, чтобы хроматин имел соответствующий размер и концентрацию. Избыточное переваривание хроматина может уменьшить сигнал при количественной оценке ПЦР. Недостаточное переваривание хроматина может привести к усилению фонового сигнала и снижению разрешения. Добавление слишком малого количества хроматина к IP может привести к снижению сигнала при количественной оценке ПЦР.

Иммунопреципитация хроматина

Для получения оптимальных результатов ChIP используйте приблизительно от 5 до 10 мкг расщепленного сшитого хроматина на реакцию IP.Обычно 100 мкл расщепленного хроматина разводят в 400 мкл 1X ChIP Buffer перед добавлением антител. Однако, если на IP требуется более 100 мкл хроматина, препарат сшитого хроматина не нужно разбавлять, как описано ниже. Антитела можно добавлять непосредственно в неразбавленный препарат хроматина для иммунопреципитации хроматиновых комплексов.

Перед запуском
• Разогрейте коктейль с 200-кратным ингибитором протеазы (PIC). Убедитесь, что PIC полностью разморожен.
• Нагрейте 10-кратный буфер ChIP и убедитесь, что SDS полностью растворен.
• Размороженный препарат хроматина разморозить и поместить на лед.
• Приготовьте промывку с низким содержанием соли: 3 мл 1X ChIP Buffer (300 мкл 10X ChIP Buffer + 2,7 мл воды) на реакцию. Хранить при комнатной температуре до использования.
• Приготовьте промывку с высоким содержанием соли: 1 мл 1X буфера ChIP (100 мкл 10X буфера ChIP + 900 мкл воды) + 70 мкл 5M NaCl на реакцию. Хранить при комнатной температуре до использования.

1. В одной пробирке приготовьте достаточно 1X ChIP Buffer для разведения расщепленного хроматина до желаемого количества реакций: 400 мкл 1X ChIP Buffer (40 мкл 10X ChIP Buffer + 360 мкл воды) + 2 мкл 200X PIC на реакция.При определении количества реакций не забудьте включить образцы положительного контроля и отрицательного контроля. Выложите смесь на лед.
2. К приготовленному буферу 1X ChIP добавьте эквивалент 100 мкл (от 5 до 10 мкг хроматина) расщепленного препарата сшитого хроматина на реакцию.
3. Удалите 10 мкл образца разбавленного хроматина и перенесите в микроцентрифужную пробирку. Это ваш 2% входной образец, который можно хранить при -20 ° C до дальнейшего использования.
4. Для каждой реакции иммунопреципитации перенесите 500 мкл разбавленного хроматина в 1.Микроцентрифужная пробирка на 5 мл и добавьте антитело. Количество антител, необходимое для одного IP, варьируется и должно определяться пользователем. Инкубируйте образцы IP от 4 ч до ночи при 4 ° C с вращением.
5. Ресуспендируйте магнитные шарики с протеином A / G, осторожно встряхивая. Немедленно добавьте 30 мкл магнитных шариков Protein A / G в каждую реакцию IP и инкубируйте в течение 2 ч при 4 ° C с вращением.
6. Гранулы белка A / G на магнитных гранулах, поместив пробирки в магнитный сепаратор. Подождите 1-2 мин, пока раствор не станет прозрачным, а затем осторожно удалите супернатант.
7. Вымойте магнитные шарики, добавив 1 мл промывочного раствора с низким содержанием соли, и инкубируйте при 4 ° C в течение 5 минут при вращении. Повторите шаги 6 и 7 еще два раза.
8. Добавьте к шарикам 1 мл промывного раствора с высоким содержанием соли и инкубируйте при 4 ° C в течение 5 минут при вращении.
9. Гранулируйте магнитные шарики, поместив трубки в магнитный сепаратор. Подождите 1-2 мин, пока раствор не станет прозрачным, а затем осторожно удалите супернатант.

Элюирование хроматина и обращение поперечных сшивок

Перед запуском
• Нагрейте буфер для элюирования 2X ChIP на водяной бане с 37 ° C и убедитесь, что SDS находится в растворе.
• Установите водяную баню или термомиксер на 65 ° C.
• Подготовьте 150 мкл буфера для элюции 1X ChIP для каждой реакции и 2% входного образца.

1. Добавьте 150 мкл буфера для элюирования 1X ChIP в пробирку с 2% входным образцом и отставьте при комнатной температуре до этапа 6.
2. Добавьте 150 мкл буфера для элюции 1X ChIP в каждый образец IP.
3. Элюируйте хроматин с антител / магнитных шариков в течение 30 минут при 65 ° C, осторожно встряхивая (1200 об / мин).
4. Магнитные гранулы гранул белка A / G путем магнитной сепарации.
5. Осторожно перенесите элюированный супернатант хроматина в новую пробирку.
6. Во все пробирки, включая 2% -ный образец, полученный на этапе 1, выполните обратные перекрестные связи, добавив 6 мкл 5M NaCl и 2 мкл протеиназы K, и инкубируйте 2 часа при 65 ° C. Инкубацию можно продлить на ночь.
7. Сразу приступаем к следующей части. В качестве альтернативы образцы можно хранить при -20 ° C. Однако, чтобы избежать образования осадка, обязательно нагрейте образцы до комнатной температуры перед добавлением буфера для связывания ДНК.

Очистка ДНК

Эта часть была выполнена при комнатной температуре
1.Добавьте 750 мкл буфера для связывания ДНК в каждый образец ДНК и быстро встряхните.
• На каждый 1 объем образца следует использовать 5 объемов буфера для связывания ДНК.
2. Перенесите 450 мкл каждого образца из этапа 1 на спин-колонку ДНК в пробирке для сбора.
3. Центрифуга при 14 000 об / мин в течение 30 сек.
4. Слейте жидкость из сборной трубки и замените спин-колонку в сборной трубке.
5. Перенесите оставшиеся 450 мкл каждого образца из этапа 1 в спин-колонку в пробирке для сбора. Повторите шаги 3 и 4.
6. Добавьте 750 мкл буфера для промывки ДНК (с добавлением этанола) в спин-колонку в пробирке для сбора.
7. Центрифуга при 14000 об / мин в течение 30 секунд.
8. Слейте жидкость из сборной трубки и замените спин-колонку в сборной трубке.
9. Центрифуга при 14000 об / мин в течение 30 секунд.
10. Выбросьте пробирку для сбора и жидкость. Сохраните спин-колонку.
11. Поместите спин-колонку в новую чистую микроцентрифужную пробирку на 1,5 мл и добавьте 50 мкл буфера для элюции ДНК в каждую спин-колонку.